第8卷第9期环境工程学报Vol．8，No．92014年9月ChineseJournalofEnvironmentalEngineeringSep．2014利用微藻同步实现CO2生物固定与养殖废水脱氮除磷赵云陈家城沈英王鹭徐新苗（福州大学机械工程及自动化学院，福州350116）摘要文章欲通过对小球藻Chlorellasp．的优化培养提高微藻的固碳率以及对养殖废水中氮、磷的去除率。探讨了光强、初始氮浓度（ITNC）、CO2通气比、通气间隔时间和连续培养时间等因素对Chlorellasp．固定CO2和净化污水的能力的影响。结果表明，在光强240μmol/（m·s）、初始氮浓度128mg/L、通气比0．3m3/（m3·min）、通气通断间隔15s/60s条件下培养10d，微藻达到最高固碳率564．67mg/（L·d），与此同时，氮、磷去除率和生物质浓度分别达到66．72%、55．95%和3．50g/L。关键词微藻培养二氧化碳污水生物质Chlorellasp．中图分类号X511文献标识码A文章编号1673-9108（2014）09-3553-06MicroalgalcultureforCO2fixationandmanurewastewatertreatmentZhaoYunChenJiachengShenYingWangLuXuXinmiao（CollegeofMechanicalEngineeringandAutomation，FuzhouUniversity，Fuzhou350116，China）AbstractTheobjectiveofthispaperwastounderstandandoptimizebothCO2fixingandnutrientremovalbyculturingChlorellasp．Theinfluencesoflightintensity，initialtotalnitrogenconcentration（ITNC），aerationrate，aerationperiodandculturedurationonCO2fixingrateandnitrogen/phosphorsremovingrateofChlorellasp．wereinvestigated．TheresultsshowedthatthemaximumCO2fixingrateof564．67mg/（L·d）withbiomassconcentrationof3．50g/L，nitrogenandphosphorsremovalratesof66．72%and55．95%wereachievedundertheoptimalconditions：lightintensityof240μmol/（m2·s），ITNCof128mg/L，aerationrateof0．3m3/（m3·min），aerationperiodof15s/60s（on/off）andculturedurationof10days．Keywordsmicroalgaecultivation；carbondioxide；wastewater；biomass；Chlorellasp．基金项目：国家自然科学基金资助项目（51108085）；国家高技术研究发展计划（863）项目（2012AA021704）；福建省高校杰出青年科研人才计划（JA12018）；福建省自然科学基金项目（2013J01129）收稿日期：2013－08－22；修订日期：2013－12－18作者简介：赵云（1957～），男，副教授，主要研究方向：可再生能源。E-mail：zyun@fzu．edu．cn通讯联系人，E-mail：yshen@fzu．edu．cn随着人类社会的发展，CO2排放量逐年递增，温室效应日趋严重。2011年全球CO2排放量增加了3%，总排量达340亿t，而我国占了29%，位居世界第一［1］。所以寻求有效可行的CO2减排方法迫在眉睫。另一方面，以生物能源为代表的可再生能源的加速扩大，为CO2减排做出了巨大贡献，如果没有可再生能源的发展，2011年全球CO2排放量可能增加5%［1］。目前以微藻为原料的生物燃料无法实现大规模工业化的主要瓶颈是其生产成本过高［2］。生物柴油的成本要想与100美元/桶的化学石油经济效益相当，至少要低于340美元/t，然而目前生产生物柴油的成本远远高于这个值，大概需要3000美元/t［3］。成本过高的原因之一就是培养过程的成本投入过大［2］。前人对如何降低微藻培养成本，做过大量研究，提出了“污水-微藻-能源”串联技术体系的概念，指出了从微藻自身特点出发，将微藻在污水净化与生物质能源生产上的优势有机结合起来，用污水提供微藻生长所需的氮、磷营养盐，以低成本、高效开发利用微藻生物质能源［4］。研究表明利用城市生活污水培养含油微藻可以在获得微藻油脂产品的同时实现水体的氮磷无害处理［5］。本文则提出将微藻在CO2生物固定、污水净化和生物质能源生产上的优势耦合起来，致力于利用微藻固定工业排放的CO2和净化养殖场废水的同时，充分利用其产生的生物质能来生产生物燃料，为降低生物燃料大规模生产成本提供理论研究依据。研究表明，微藻的固碳效果受到CO2浓度［6］、环境工程学报第8卷微藻菌株［7，8］、通气量［9］、光照强度和污水中的总氮浓度［10］等因素的影响。在0．5%CO2浓度下，小球藻Chlorellavulgaris的固碳率可达35%，而当CO2浓度提高至12%时，C．vulgaris的固碳率只有2%［6］。小球藻ChlorellaZY-1在70%CO2浓度下仍能缓慢地生长，而在10%CO2浓度下有最大生长速率，可达1．17g/（L·d），但其固碳率仅为0．574%［11］。通气量除了可以通过单位时间内的通气速率来控制外，还可以通过设置通气的通断时间间隔来控制。合理设置通气间隔时间可以消除连续通入高浓度CO2对微藻生长的抑制作用，从而提高微藻对CO2耐受能力和利用率［9］。本研究以小球藻Chlorellasp．的固碳率为主要优化培养目标，并对比Chlorellasp．在不同条件下的去氮、磷率以及生物质产量。分析了在强、弱两种光强条件下，初始氮浓度、通气比、通气间隔时间和培养时间对固碳率和去污能力的影响。1材料与方法1．1藻种及育种小球藻（Chlorellasp．）来源于福建盛呇能源科技有限公司。藻种育种采用ModifiedBasal［12］培养液，其成分为：尿素1．0g/L；KH2PO41．25g/L；Mg-SO4·7H2O1．0g/L；CaCl20．0838g/L；EDTA-2Na0．5g/L；FeSO4·7H2O0．0498g/L，MnCl2·4H2O0．0142g/L；Co（NO3）2·6H2O0．0049g/L；ZnSO4·7H2O0．0882g/L；CuSO4·5H2O0．0157g/L；H3BO30．1142g/L。微藻扩增培养条件为：光照强度95μmol/（m2·s），温度（26±1）℃，光照周期12h/12h（昼/夜），pH为8．0±0．5，CO2浓度2%（工业CO2气体与空气混合而成，混合体积比2∶98），通气比（即单位时间内单位体积培养液的通气量）0．15m3/（m3·min）。1．2培养系统及实验条件藻种育种和优化实验都采用如图1所示的培养系统进行。该系统主要由光照部分、通气部分和培养部分构成。其中，光照部分由不同排列密度的日光灯组成，以得到2种不同的光照强度；通气部分由CO2气瓶、空气泵、混气箱、继电器以及气管组成；培养部分由若干直径7cm长75cm的透明塑料袋子组成，每一个袋子中装有1．5L培养液。优化实验采用预处理过的养殖废水为培养基。污水来源于福州市上街镇溪源宫养猪场。将粪池里图1实验培养系统示意图Fig．1Schematicdiagramofculturesystem的粪进行24～48h的浸泡后，用多层纱布反复过滤后进行灭菌处理以备使用。预处理后污水的基本理化性质为：深褐色，pH6．5，总氮浓度（365．25±8．45）mg/L，总磷浓度（134．05±0．85）mg/L。实验以工业CO2和空气混合成10%CO2浓度的混合气来模拟工业废气。实验接种10%体积的处于对数生长期的藻液。培养条件为：温度（26±1）℃，pH为8．0±0．5，光照周期12h/12h（昼/夜）。所有优化实验均在相同条件下重复2次。1．3实验设计实验设计如表1所示，在强光（240μmol/（m2·s））和弱光（95μmol/（m2·s））2种条件下，分别比较连续培养时间、初始氮浓度、通气间隔时间以及通气比4个参数对Chlorellasp．的固碳及去污效果的影响。表1实验设计表Table1Designofexperimenttable因素水平培养时间（d）ITNC（mg/L）通气比（m3/（m3·min））通气间隔（s/s）培养时间－151280．315/600101280．315/60+1151280．315/60ITNC－110640．315/600101280．315/60+1102560．315/60通气比－1101280．1515/600101280．315/60+1101280．4515/60通气间隔－1101280．315/300101280．315/60+1101280．315/1201．4分析方法1．4．1生物质浓度及pH测定实验过程中，每天通过测定吸光度（opticalden-4553第9期赵云等：利用微藻同步实现CO2生物固定与养殖废水脱氮除磷sity：OD）对微藻的生长情况进行监测。OD测量是借助可见分光分度计（722N，上海佑科仪器仪表有限公司）在682nm波长下测定完成的。实验结束后通过抽滤的方式测量微藻的生物质浓度，即测量滤膜在抽滤前后的重量差并结合抽滤的微藻体积数计算得到，滤膜的烘干温度为105℃，4h。OD与生物质浓度之间的换算公式为：y=0．232OD682+0．054（1）式中：y表示微藻生物质浓度，g/L。为避免因通入高浓度CO2而引起培养液酸化从而导致抑制生长，实验过程中每天通过pH试纸测量样品pH值，并通过0．5mol/LNaOH溶液调节pH值至8±0．5。1．4．2污水总氮、总磷测定实验过程中，隔天取样测定培养污水中总氮、总磷的含量，以监测微藻生长过程中对氮、磷的吸收情况。总氮、总磷的测定分别采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法（GB11894-89），和钼酸铵分光光度法（GB11893-89）（多参数水质分析仪5B-3B（A）型，连华科技）。1．4．3固碳率计算实验结束后，将微藻生物质进行冷冻干燥（LGJ-10，北京松源华兴科技发展有限公司），并采用元素分析仪（varioELcube，德国elementar公司）测得Chlorellasp．的含碳量为43．90%。固碳率的计算表达式为［13，14］：CFＲ=CCMCO2MCPb（2）式中：CFＲ为固碳率（mg/（L·d））；CC为干细胞碳含量（43．90%）；MCO2为CO2的分子量（44）；MC为C的分子量（12）。Pb表示微藻生物质产量（mg/（L·d））。2实验结果2．1培养时间的影响图2所示为在2种光强条件下，培养时间对Chlorellasp．固碳率和氮、磷的去除率的影响。数据表明在不同培养周期内，Chlorellasp．的固碳率受到光照强度的影响。在强光条件下，培养10d可达到最高固碳率564．67mg/（L·d），与此同时，生物质浓度与氮、磷去除率分别为（3．5±0．2）g/L、66．72%和55．95%。当培养周期延长至生长稳定期后，由于微藻的生长速度有所下降，导致固碳率下降。在弱光条件下，培养周期对固碳率的影响不显著，且平均固碳率相对强光条件下的固碳率低。在2种光强条件下，延长培养周期都可以不同程度地提高Chlorellasp．的氮、磷的去除率。图2培养时间对固碳率和氮、磷的去除率的影响Fig．2EffectofculturedurationonCFＲandTN/TPremovalrate2．2初始氮浓度的影响图3所示为在2种光强条件下，初始氮浓度对Chlorellasp．固碳率和氮、磷的去除率的影响。在强光条件下，初始氮浓度为128mg/L时，Chlorellasp．达到最高固碳率为564．67mg/（L·d），与此同时，生物质浓度与氮、磷去除率分别为（3．5±0．2）g/L、66．72%和55．95%。进一步提高初始氮浓度有可能抑制微藻生长从而降低微藻对碳、氮、磷3种元素的吸收。在弱光条件下，Chlorellasp．的平均固碳率有所降低，固碳率随着初始氮浓度的提高而提高。当初始氮浓度为256mg/L时，最高固碳率为464．64mg/（L·d），与此同时，生物质浓度与氮、磷去除率分别为（2．13±0．05）g/L、63．42%和43．33%。数据表明初始氮浓度和光强的交互作用对微藻的生长具有明显影响。在充足光照强度条件下，通入CO2能极大提高Chlorellasp．对高浓度氮抑5553环境工程学报第8卷制的抵抗能力。图3初始氮浓度对固碳率和氮、磷的去除率的影响Fig．3EffectofinitialtotalnitrogenconcentrationonCFＲandtotalnitrogen/totalphosphorusremovalrate2．3通气比的影响图4所示为在2种光强条件下，通气比对Chlo-rellasp．固碳率和氮、磷的去除率的影响。在强光条件下，通气比提高至0．3（m3/（m3·min））时，达到最高固碳率为564．67mg/（L·d）。当通气比进一步提高，微藻的生长反而会受到抑制，从而降低对碳的吸收。在弱光条件下，通气比对Chlorellasp．的固碳率影响不显著，且明显低于强光条件的固碳率。在2种光强条件下，通气比对氮、磷的去除率影响不显著。2．4通气间隔时间的影响图5所示为在2种光强条件下，通气间隔时间对Chlorellasp．固碳率和氮、磷的去除率的影响。在强光条件下，通气间隔为15s/60s时，达到最高固碳率为564．67mg/（L·d）。进一步延长间隔时间可促进Chlorellasp．对氮、磷的去除率，但固碳率有所下降。当通气间隔为15s/120s时，氮、磷去除率分别达到90．05%和68．82%，与此同时，生物质浓度和固碳率分别为（3．06±0．06）g/L和493．68mg/（L·d）。图4通气比对固碳率和氮、磷的去除率的影响Fig．4EffectofaerationrateonCFＲandTN/TPremovalrate3讨论文献报道光照强度是影响微藻生长的关键因素之一，通常微藻在光强为（60～120）μmol/（m2·s）的范围内生长较快，光强过高（＞200μmol/（m2·s））易产生光饱和现象从而抑制微藻的生长［15］。然而微藻对光照强度的需求又与营养素、生长速度、培养密度等因素有关［16］。一方面营养元素可以提高微藻对光的需求能力，另一方面较高光强也可以促进微藻对营养元素的需求。例如，在230mg/L初始氮浓度条件下，二形栅藻的光饱和点为510μmol/（m2·s）［17］。在本研究中，Chlorellasp．在强光条件下的固碳率总体高于弱光条件。数据表明，在240μmol/（m2·s）光强条件下，Chlorellasp．能更好的适应总氮浓度较高的污水，可能是因为光强可以提高微藻对营养物质的吸收，进而提高生长率［18］。生长率的提高就促进了Chlorellasp．对碳的吸收。培养时间和初始氮浓度是决定微藻生物质产量以及去污能力的主要因素。有研究发现，微藻在培养8～10d有最大生长速率［19，20］，且培养7～11d6553第9期赵云等：利用微藻同步实现CO2生物固定与养殖废水脱氮除磷图5通气间隔时间固碳率和对氮、磷的去除率的影响Fig．5EffectofaerationperiodonCFＲandTN/TPremovalrate能较好吸收氮、磷元素［21］。初始氮浓度直接影响微藻利用氮、磷等营养元素的能力。当初始氮浓度低于185．25mg/L时，微藻可以较好地吸收培养液中的无机氮［5］；而当初始氮浓度高于283mg/L，微藻的去氮、磷能力急剧下降［15］。在本研究中Chlorellasp．在128mg/L的初始氮浓度下，培养10d可达到最高固碳率。可能是因为在该条件下，较低初始氮浓度时，微藻生长所需的氮营养盐无法得到充足的补充，从而导致细胞分裂减缓，使其生长速率下降。而在较高初始氮浓度状态下，可能细胞分裂所需的其他营养元素无法得到充足供给，或者由于总氮浓度过大，抑制了微藻细胞分裂过程中所需分泌物的分泌，而使微藻生长减缓。在微藻培养过程中，CO2的通入量是影响微藻固碳率的最主要原因之一［13，14］。而CO2的通入量与气体浓度、通气比和通气通断间隔时间有关［8］。在本研究中，通气间隔时间的延长有助于提高微藻去除氮、磷的能力，然而间隔时间过长或过短微藻生物质产量均有所下降。通气时间间隔适中，微藻就有足够的时间固定CO2，也可以减缓因CO2溶解量过大而引起的抑制生长［8］。培养液中溶解CO2的量是影响微藻生长的抑制因素［22］。而CO2的溶解量除受其浓度影响外，还受通气时间与通气速率的影响。所以微藻生长需要适宜的通气间隔时间和通气速率。通气一般会促进微藻生长，这可能要归功于通入气体中CO2的存在和气体湍流带来的混合效应［22］。通气率过小微藻就得不到充足的碳源供给和混合效应，而通气率过大可能引起培养液中的pH迅速下降，从而抑制微藻的生长。4结论（1）Chlorellasp．具有较好的固碳和净化污水的能力，为治理工业废气和净化养殖废水的耦合提供了新思路。（2）充足的光照强度和氮浓度的相互作用能极大提高Chlorellasp．对10%浓度CO2气体的耐受能力和固碳能力。（3）在光强240μmol/（m2·s）、初始氮浓度128mg/L、通气比0．3（m3/（m3·min））、通气通断间隔15s/60s条件下培养10d，微藻有最佳耦合生长、固碳和净化污水的能力。该条件下有最大固碳率564．67mg/（L·d），和较大的氮、磷去除率，分别可达66．72%和55．95%；生物质浓度可达3．50g/L。参考文献［1］OlivierJ．G．I．，PetersJ．A．H．W．，Janssens-MaenhoutG．TrendsinglobalCO2emissions2012report．PBLNeth-erlandsEnvironmentalAssessmentAgency，2012［2］AcienF．G．，FernandezJ．M．，MaganJ．J．，etal．Pro-ductioncostofarealmicroalgaeproductionplantandstrat-egiestoreduceit．BiotechnologyAdvances，2012，30（6）：1344-1353［3］ChistiY．Biodieselfrommicroalgaebeatsbioethanol．TrendsinBiotechnology，2008，26（3）：126-131［4］蔡卓平，段舜山，朱红惠．“污水-微藻-能源”串联技术新进展．生态环境学报，2012，21（7）：1380-1386CaiZ．P．，DuanS．S．，ZhuH．H．Ｒecentadvanceonsewage-microalga-biofulecouplingtechnology．EcologyandEnvironmentSciences，2012，21（7）：1380-1386（inChi-nese）［5］吕素绢，张维，彭小伟，等．城市生活废水用于产油微藻培养．生物工程学报，2011，27（3）：445-4527553环境工程学报第8卷LüS．J．，ZhangW．，PengX．W．，etal．Cultivatinganoleaginousmicroalgaewithmunicipalwastewater．Chi-neseJournalofBiotechnology，2011，27（3）：445-452（inChinese）［6］LüJ．M．，ChengL．H．，XuX．H．，etal．Enhancedlip-idproductionofChlorellavulgarisbyadjustmentofcultiva-tionconditions．BioresourceTechnology，2010，101（17）：6797-6804［7］MoraisM．G．D．，CostaJ．A．V．Bio-fixationofcarbondioxidebySpirulinaspandScenedesmusobliquuscultivatedinathree-stageserialtubularphoto-bioreactors．JournalofBiotechnology，2007，129（3）：439-445［8］MoraisM．G．D．，CostaJ．A．V．CarbondioxidefixationbyChlorellakessleri，C．vulgaris，ScenedesmusobliquusandSpirulinasp．cultivatedinflasksandverticaltubularphotobioreactors．JournalofBiotechnology，2007，29（9）：1349-1352［9］HeL．，SubramanianV．Ｒ．，TangY．J．Experimentala-nalysisandmodel-basedoptimizationofmicroalgaegrowthinphoto-bioreactorsusingfluegas．BiomassandBioener-gy，2012，41（6）：131-138［10］刘建强，刘玉环，阮榕生，等．利用市政污水培养Chlorellavulgaris生产生物柴油．生物加工过程，2011，9（1）：10-14LiuJ．Q．，LiuY．H．，ＲuanＲ．S．，etal．CultivatingChlorellavulgarisasbiodieselfeedstockbymunicipalwastewater．ChineseJournalofBioprocessEngineering，2011，9（1）：10-14（inChinese）［11］YueL．H．，ChenW．G．IsolationanddeterminationofculturalcharacteristicsofanewhighlyCO2tolerantfreshwatermicroalgae．EnergyConversionandManagement，2005，46（11-12）：1868-1876［12］ShenY．，YuanW．Q．Comparisonofbiomassandoilproductivityofselectedmicroalgaeinlivestockwastewater．AdvancedMaterialsＲesearch，2012，393（11）：655-658［13］KetheesanB．，NirmalakhandanN．Feasibilityofmicroal-galcultivationinapilot-scaleairlift-drivenracewayreac-tor．BioresourceTechnology，2012，108（3）：196-202［14］VanDenHendeS．，VervaerenH．，BoonN．Fluegascompoundsandmicroalgae：（Bio-）chemicalinteractionsleadingtobiotechnologicalopportunities．BiotechnologyAdvances，2012，30（6）：1405-1424［15］W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